Molekuláris diagnosztika: várakozások és reális lehetőségek

A Humán Genom Projekt (HGP) befejezése után egy évvel a laikus is érdeklődéssel fordul a genetikai eredmények felé, és kíváncsian várja például az emberi klónozással kapcsolatos híreket. Bár a közvélemény a HGP vagy a többi lenyűgöző genetikai kutatási eredmény lényegét kevéssé érti, mégis sokan megsejtették, hogy ezek az eredmények a közeli jövőben jelentősen megváltoztatják majd életünket. Némileg hasonló a helyzet az orvostudományban is: egyre többen vannak azok, akik várakozással tekintenek az új genetikai információkra és a kibontakozó technológiai fejlődésre, bár egyelőre nincs közvetlen tapasztalatuk a változások várható dinamikájával kapcsolatban. Ez az írás egyrészt a reálisan hozzáférhető molekuláris diagnosztikai lehetőségeket villantja fel a teljesség igénye nélkül, másrészt igyekszik néhány példával illusztrálni azt a paradigmaváltást, amely a genetikai kérdésfeltevésből kiindulva elkerülhetetlenül átalakítja az orvosi ténykedés teljes spektrumát, a diagnosztikától egészen a terápiáig.

Kétségkívül a Humán Genom Projekt az orvosbiológiai vonatkozású kutatások eddigi leggrandiózusabb vállalkozása, de a projektből kibontható információk széles körű alkalmazására még várni kell. A gének működésének precíz megértése gyakran sokkal komplikáltabb, mint eredetileg várták. A multiplex etiológiájú betegségekre (például szív- és érrendszeri betegségekre) hajlamosító minor genetikai tényezők pontos listája és e tényezők eredő hatásai sem ismertek egyelőre. Másfelől azokat a módszereket, amelyekkel ezek a genetikai tényezők nagy számban (több mint 5000-10000 paraméter egyszerre), rutinszerűen, gyorsan és olcsón vizsgálhatók, még a fejlesztőlaboratóriumok ajtaja rejti el előlünk. (Ez még akkor is igaz, ha például a sokat emlegetett DNS-csiptechnológia is látványos fejlődésen ment keresztül az utóbbi 2-3 évben és mellesleg olcsóbbá is vált.) A változások dinamikáját tehát nehéz megjósolni, de várhatóan 3-5 év múlva most még meglepőnek számító összetett kérdésekre kaphatunk majd választ.

Mi is az a molekuláris diagnosztika?

Mielőtt elmerülünk néhány részletben, érdemes meghatározni vagy talán minél pontosabban körülírni, mit szoktak általában a molekuláris diagnosztika gyűjtőkörébe sorolni. A molekuláris diagnosztika mindenképpen egy nukleinsavak manipulációjával összekapcsolódó fogalom. Első megközelítésben dezoxiribonukleinsav- (DNS-), másrészt ribonukleinsav- (RNS-) preparátumok előállítására irányul, majd ezek speciális tulajdonságait igyekszik felderíteni érzékeny molekuláris biológiai eljárások segítségével. A molekuláris diagnosztika tehát sajátos eszköz és megközelítési mód, amely az egyes tudományos diszciplínák, például a molekuláris patológia vagy az orvosi mikrobiológia területén felmerülő kérdések megválaszolására alkalmazható. A molekuláris patológia területén a molekuláris diagnosztika eszközeivel a genetikai elváltozásokat a klinikai fenotípussal összekapcsoló mechanizmusokra igyekszünk fényt deríteni. Manapság a molekuláris mikrobiológia esetében rendkívül kis mennyiségű kórokozó gyors és specifikus kimutatása a leggyakoribb cél.

A mikrobiológiai diagnosztikába a molekuláris biológiai módszerek azokon a pontokon csatlakoznak be, ahol a klasszikus tenyésztési, biokémiai és szerológiai módszerek nem eléggé érzékenyek, lassúak, kicsi a specifikusságuk vagy az új terápiás megközelítések támogatására már nem alkalmasak. A tenyésztési problémák kiküszöbölésére terjedtek el a szexuális úton terjedő betegségek diagnosztikájában a Chlamydia trachomatis és a Neisseria gonorrhoeae PCR-vizsgálatok. A Chlamydia trachomatis-átfertőzöttség jelentős a szexuálisan aktív, felnőttkorú populációban. A PCR-diagnosztika bevezetése, a módszer szenzitivitása és robosztussága tette lehetővé a populációszintű Chlamydia trachomatis-szűrési programok sikeres megvalósítását az egyes országokban, például Kanadában. A Mycobacterium tuberculosis esetében a molekuláris biológiai módszerrel rendkívül gyorsan, akár néhány napon belül nyerhető válasz biztosítja a gyors terápiás döntés lehetőségét. A humán papillomavírus időbeni molekuláris diagnosztikai kimutatásával a potenciálisan cervixrákká fejlődő folyamat terelhető pozitív irányba. A molekuláris diagnosztika az egyéb klinikai adatokkal kombinálva ebben az esetben a megelőző sebészi beavatkozást indokolja vagy teszi feleslegessé. A legkorszerűbbnek számító és az elmúlt két évben Magyarországon is látványosan terjedő valós idejű (real-time) fluoreszcens PCR-rendszerek segítségével sürgős esetben a mikrobiológiai mintavételtől számított 3-5 órán belül adható megbízható laboratóriumi eredmény.

Éppen az érzékenység és a megfelelő specifikusság kombinációja miatt vált nemzetközileg elfogadottá a vérkészítmények előállításához használt donorvér hepatitis B, C és HIV-vírus vizsgálatainál a PCR-alapú módszerek alkalmazása. Sajnos, a szerológiailag (még) negatív donorok között akut vírusfertőzött személyek is lehetnek, ilyen esetben kizárólag a molekuláris biológiai módszerrel végzett víruskimutatással zárható ki a fertőzés potenciális átvitele. Ezek a módszerek alkalmasak az automatizálásra, szimultán nagyszámú minta vizsgálatára (2-3 óra alatt egyszerre akár 100 minta vizsgálható), így nagy tömegű szűrés céljára is jól felhasználhatók. Hazánkban egyelőre azonban csak szerológiai módszerekkel szűrik a donorvért, és a molekuláris biológiai szűrőmódszerek rutinszerű bevezetése még várat magára.

Az individuális terápia lehetősége

A molekuláris biológiai módszerek előretörése miatt a mikrobiológiai diagnosztikai kérdésfeltevésben is gyors váltás várható. Egyes kórokozók terápia iránti érzékenysége, az antibiotikum-rezisztencia molekuláris biológiai módszerekkel is vizsgálhatók. Ennek egyik legmeggyőzőbb példája a HIV-terápia korszerű megközelítéséhez kapcsolódik. A HIV-vírus genomját egy reverz transzkriptáz enzim reprodukálja a vírus szaporodása során. Minden egyes replikáció során több mutáció is képződik, a mutációk következtében a vírussal szemben korábban hatékonynak bizonyult gyógyszerek elveszítik hatásukat. Az új megközelítésben egy rendkívül érzékeny „nested” PCR-reakciót követően először fluoreszcens DNS-szekvenálással pontosan meghatározzák a vírusgenom terápiás szempontból legfontosabb 2 génjének, a HIV-proteáz és a reverz transzkriptáz gének szekvenciáját¹. Ezt a szekvenciát összehasonlítják egy HIV-adatbázisban tárolt adatokkal. Az adatbázisban a genetikai variánsok adatai összevethetők a különböző variánsok esetében leghatékonyabbnak bizonyult gyógyszer-kombinációkkal is. E komplex összehasonlító elemzőmunka végeredményeként a betegben található HIV-vírust leghatékonyabban pusztító gyógyszer-kombináció állítható össze. Az individuális terápia még tovább finomítható: ha a beteg, illetve a szervezetében található HIV-vírus rezisztenssé válik az alkalmazott gyógyszerekre, egy újabb genotipizálást követően váltani lehet az újabb, leghatékonyabb gyógyszer-kombinációra.

A molekuláris biológiai módszerrel nyert információ segítségével számos súlyos fertőző betegség kezelését lehet célzottá, valóban individuálissá tenni olyan esetekben is, ahol a klasszikus tenyésztési stb. módszerek egyáltalán nem adnak választ a klinikus legfontosabb kérdéseire. A mikrobiológiai diagnosztikában a genotípus-fenotípus összefüggések vizsgálata közül a fertőző betegségekre hajlamosító genetikai tényezők vizsgálatai is nagy érdeklődésre tarthatnak számot. Svéd kutatók anyakönyvi regiszterek, valamint a múlt századig visszanyúló svéd rákregiszter és az országos családfaregiszter analízise alapján azonosítottak egy svéd családokban előforduló genetikai hajlamot, amely a perzisztáló humán papillomavírus-fertőzésre, illetve a cervixrák kialakulására hajlamosít².

Az OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man)³ adatbázisában már megközelítőleg 8000, emberi betegségekben szerepet játszó génszekvencia variánsait gyűjtötték össze. E variánsok hatása gyakran ismeretlen és túlnyomó többségük egyelőre a polimorfizmus jelzővel vár további funkcionális vizsgálatokra. A monogénes betegségekhez kapcsolódó azonosított mutációk száma is gyors iramban bővül. Gyakran a molekuláris diagnosztikában rutinszerűen alkalmazott módszerek kapacitása szab határt a szimultán vizsgálható paramétereknek. Diagnosztikai szempontból rendkívül fontos a vizsgálni kívánt fehérjék, illetve gének esetében az adott populációra különösen jellemző alapító (founder) mutációk vizsgálata. Az alapító mutációk problémája a több gyakori mutációt hordozó gének esetében kiemelt jelentőségű, hiszen az adott betegséghez kapcsolódó mutációs spektrum legalább 95%-os felderítése az optimális esetben elérendő cél. Hazánkban például a BRCA1 gén leggyakoribb magyarországi mutációs változatait a kutatások eredményeként alaposan ismerjük⁴. Más gének esetében, például a cisztikus fibrózis gén (CFTR) teljes magyar mutációs spektrumának feltérképezése még folyamatban van.

A molekuláris diagnosztika alkalmazása az onkohematológiai betegségek esetében is fontos segítséget nyújthat a terápia hatékonyságának monitorozásához. A legújabb diagnosztikai irányelv alapján a betegek tumorsejtjeiben meghatározzák a betegség kialakulásában központi szerepet játszó kromoszómaelváltozásokat (például azonosítják a kromoszómatranszlokáció pontos molekuláris szerkezetét). Ezeket az információkat a későbbiekben felhasználva kvantitatív valós idejű fluoreszcens PCR-rendszerben vizsgálható a leukémiás sejtek mennyisége a betegektől nyert mintákban. Az egész eljárás célja, hogy a minimális reziduális betegség a korábban alkalmazott módszereknél sokkal érzékenyebben és precízebben monitorozható a molekuláris diagnosztika módszereinek felhasználásával. E rendszer bevezetése rendkívüli körültekintést és felkészültséget kíván a laboratóriumtól, így Európában egy nemzetközi konzorcium keretében 11 ország több független laboratóriuma dolgozik közösen a módszerek standardizálásán, az egységes értékelés alapelveinek lefektetésén⁵.

A tumorgenetikával foglalkozó kutatók számára az egyik legfontosabb célkitűzés, hogy megkeressék az adott tumor különböző formáival, biológiai viselkedésével kapcsolatba hozható géneket és jellemezzék e génkészlet aktivitását. E génkészlet aktivitása nemcsak a tumor klinikai megjelenési formáit határozza majd meg, hanem a terápiára adott választ is befolyásolja. Az adott tumor viselkedésének megértéséhez akár egyszerre 10000 gén aktivitását kell megvizsgálni, és e feladathoz nyújtanak segítséget a gyakran emlegetett DNS-csipek. A DNS-csip (microarray) felületén sűrűn elhelyezett (rövid) DNS-szálak képesek az aktív génekről átíródó mRNS-molekulák megkötésére, így az aktív gének azonosítására. A 10000 gén vizsgálatával nyert genetikai profil rendkívül egyedi, jellemző az adott tumorra és összekapcsolható a tumorok agresszivitására, terápia iránti érzékenységére vonatkozó klinikai adatokkal. Ezeknek az összefüggéseknek a tisztázása segít majd az indokolt esetekben az agresszív kemoterápia vagy radioterápia alkalmazásában, másrészt az indokolatlan esetekben csökkenti a súlyos mellékhatások veszélyét. Ilyen jellegű vizsgálatokat eddig elsősorban emlőtumorok⁶ és limfómák esetében végeztek. Ezek az eredmények rendkívül ígéretesek, de a módszer rutinszerű alkalmazásához olcsóbb technológiára és számos klinikai tanulmányra van még szükség.

Fejlődési lehetőségek

A molekuláris diagnosztika még számos tekintetben manufakturális jellegű jegyeket visel magán. Bár egyre több gyárilag összeállított, validált teszt áll rendelkezésre, gyári rendszerek hiányában a laboratóriumok saját vizsgálati rendszereket fejlesztenek ki. Akár gyári rendszerek alkalmazásáról van szó, akár saját vagy irodalmi rendszerek bevezetéséről, a manufakturális jelleg miatt a külső minőségbiztosítási programokban (körvizsgálatokban) való részvétel különösen fontos a laboratórium teljesítményének megítélése szempontjából. Az automatizálás egyre több paraméterre fog kiterjedni, de a hihetetlen technológiai heterogenitás miatt a saját fejlesztésű molekuláris biológiai vizsgálatokat még hosszú időn keresztül megtaláljuk majd a laboratóriumok palettáján. A fejlődésnek már ebben a fázisában is különösen fontos a módszerek alkalmazására vonatkozó szakmai irányelvek, diagnosztikai algoritmusok rendszeres összeállítása és a nemzetközi tendenciáknak megfelelő frissítése.

A molekuláris diagnosztika honi perspektíváit rendkívül pozitívan befolyásolják a kutatási projektekhez kapcsolódó technológiai fejlesztések, a legkorszerűbb műszerek beszerzésének lehetősége. De hosszú távú esélyeinket tekintve nem ez a perdöntő, hiszen a technológiai fejlődés idejétmúlt lépcsőit viszonylag egyszerű átugrani. A legdöntőbb kérdéssé a molekuláris diagnosztikai képzés meghonosítása vált, mert a fejlett országokban a molekuláris diagnosztika határterületeit hosszú évek óta önálló diszciplínaként oktatják a tudomány- és orvosegyetemeken. Hazánkban a megfelelő programok már beindultak az orvosegyetemi PhD-képzésben, de a graduális képzésben halaszthatatlan az önálló tárgyként történő bevezetés (ahol ez még várat magára), másrészt a posztgraduális képzésben az önálló rezidens programok beindítása. Ehhez kell kapcsolódnia egy korszerű genetikai tanácsadó képzésnek, amely különösen a komplex betegségek (például tumorok) genetikai hátterének szakértőit biztosítja az egészségügyi ellátórendszer számára. Ezek a képzett szakemberek elégíthetik majd ki a közvélemény genetikával kapcsolatos várakozását és interpretálhatják az egyre bonyolultabb diagnosztikai eredményeket.

Holló Zsolt