Molekuláris biológiai diagnózis a klinikai vizsgálatokban

A klinikai mikrobiológiai diagnosztikában a molekuláris biológiai metodikák jelentősége folyamatosan nő. A legnagyobb fejlődés az amplifikációs, ezen belül a polimeráz lácreakicós (PCR) metodikákban tapasztalható, mely fejlődés a standardizációnak és a folyamatosan növekvő klinikai ismeretanyagnak köszönhető. "Tradicionális" mikrobiológiai diagnosztikai módszerekkel csak kis érzékenységgel vagy nem detektálhatók a nem kultiválható mikroorganizmusok. Ezt a korlátot hivatott átlépni a molekuláris biológiai diagnosztika, mely azon túl, hogy a mikroorganizmus kultiválhatóságától függetlenül pontos eredményt biztosít, gyorsan, nagy specificitással és érzékenységgel tárja elénk a diagnózist.


PCR metodika

A PCR technika alapja egy kontrollált hőmérséklet-változás közben zajló amplifikációs láncreakció. A keresett organizmus genetikai állományának (DNS vagy RNS) egy jellemző szekvenciáját detektálható mennyiségre megsokszorozunk specifikus primerek és hőstabil polimeráz segítségével. Egy standard PCR-rel DNS szekvenciákat detektálhatunk, így az eljárás alkalmas különböző baktériumok, candidák, gombák, protozoák és DNS vírusok detektálására. Reverz-transzkripció PCR-rel (RT-PCR) RNS vírusok kimutatására is lehetőség nyílik. Multiplex PCR-rel egyszerre több mikroorganizmust paralel detektálhatunk egy reakcióval, kvantitatív PCR metodikával (qPCR) pedig megállapíthatjuk a fertőzés mértékét is. A hagyományos PCR technika elektroforetikus kiértékeléssel már a legtöbb mikrobiológiai laboratóriumban megvalósítható, ahol kisebb számú minta vagy kevésbé gyakori kórokozó könnyen vizsgálható ezzel a technikával. Az egyre több helyen használt Real-time PCR technika a molekuláris biológiai módszereket még vonzóbbá teszi a klinikai diagnosztikában, hiszen költséghatékonyan nagyon gyors és precíz kvantifikációt tesz lehetővé alacsony kontaminációs rizikóval és nagy reprodukálhatósággal.


PCR metodika klinikai alkalmazási lehetőségei – előnyök és korlátok

PCR metodikát azokban az esetekben célszerű használni, amikor nem vagy nehezen kultiválható mikroorganizmusok diagnosztizálása a cél (mykobaktérium, boreliák, spirocheták, chlamydiák, mykoplazmák, legtöbb vírus, szisztemikus és deramtomykózisok, protozoák). A detektálás mivel kvantitatíve is elvégezhető lehetőség nyílik arra, hogy meghatározzuk a fertőzés mértékét és nyomon kövessük a fertőzés további státuszát, (látens vagy aktív infekció) illetve a kezelés által kiváltott reakciókat és a terápia hatékonyságát. Bizonyos alkalmazások, melyeket "board-range" PCR-nek is szoktak nevezni univerzális bakteriális vagy gomba szekvenciát detektálnak. A PCR-rel történő diagnosztika a legtöbb klinikai minta esetében alkalmazható (pl.: biopszia, arhivált szövetminta, egyéb klinikai minták, stb.) és nem szükséges, hogy a vizsgálandó mokroorganizmust életben tartsuk. Ez a metódus gyors eredménnyel szolgál a hosszú kultivációs idejű patogének esetében is, ahol sokszor veszélyes patogének azonnali kimutatása szükséges (pl.: meningitis, sepsis, stb.). A mi eszközeink egy egyedülálló belső minőségi kontrollrenszer használatával minimalizálják a veszélyes fals-negatív és fals-pozitív eredmények számát, egy további belső standard pedig az inhibíció kontrollját biztosítja. A különböző patogének kimutatását célzó kitekben a primerek olvadáspontja azonos, ezért egy PCR programmal akár többféle mikroorganizmust is detektálhatunk egyidejüleg.

A PCR metodika nem kultivációs vizsgálat, ezért nem javasolt antibiotikum rezisztencia analízisre. Összehasonlítva a hagyományos kultivációs technikákkal egy mintára vetített költségigénye valamelyest nagyobb és több jártasságot igényel a molekuláris biológia terén, ami további aladályt gördíthet a metodika alkalmazása elé ha figyelembe vesszük a klinikai specialisták képzettségének irányvonalát.


PCR metodika eredményeinek klinikai értelmezése:

A következőkben a PCR metodika lehetséges eredményeit mutatjuk be:
1.Negatív eredmény (-) à megerősíthetjük, hogy a keresett mikroorganizmusból származó nuleinsavat nem tartalmazza a tesztminta.
2.Kvalitatív pozitív eredmény (+) à a mintából kimutattuk a keresett mikroorganizmusból származó nukleinsavat.
3.Kvantitatív pozitív eredmény à direkt kimutatás és egyidejűleg kimutattuk a keresett mikroorganizmusból származó nukleinsav mennyiségét a mintában (az expresszió mértéke függ a patogén tipusától és a klinikai mintától – pl.: 1 ml szérumban található vírusgenomok kópiaszáma stb.)
4.Reakció inhibíció à a klinikai minta nagy mennyiségű PCR inhibitort tartalmazott, ezért nem lehetséges a vizsgálat.
5.Alkalmatlan minta à helytelen szállítás/tárolás vagy egyéb tulajdonságok miatt a vizsgálat kritériumainak nem felelt meg a minta (pl.: koagulált vér nem alkalmas PCR tesztre, bizonyos körülmények közt nem mutatható ki a hepatitis C, stb.)

A korrekt kiértékelés általában feltételez egy összehasonlító elemzést is, melynek során más laboratóriumi metodikával – pélsául specifikus antitestekkel (vírus infekció, boreliózis, stb.) és nem specifikus infekciós markerekkel (prokalcitonin, CPR, CD23, stb.). A végső kiértékelésnek mindíg összefüggésben kell állnia a páciens klinikai állapotával.


Detektálás érzékenysége:

A nagy érzékenység együtt jár a kliniaki mintakészítés során fellépő nagy kontaminációs rizikóval. Bizonyos esetekben egy fertőzés után a klinikai anyagok már nem élő mikroorganizmusokat is tartalmazhatnak, melyek DNS-ét szintén detektálhatjuk a PCR technikával. Ezt a tényt mindíg számítsába kell venni, amikor nyálkahártya vagy vaginális kenetet, bőr biopsziát, liquort, stb-t vizsgálunk. Ezért javasolt egy további vizsgálat elvégzése három héttel a kezelés befejezése után (pl gonococci és chlamidia kenetből). Másfelől a perifériás vér mindössze néhány óráig tartalmazza a már nem élő mikroorganizmust és a DNS-t. A PCR metodika mikroorganizmusok gyors és érzékeny detektálást teszi lehetővé aszimptomatikus és látens (perzisztens) fertőzések esetében is. Ezekben az esetekben a korrekt kiértékelés eléréséhez szükséges meghatározni a detektált fertőzést – leginkább a kvantitatív detektálás (qPCR metodika) ajánlott valamilyen más diagnosztikai metodikával kombinálva (szerológiai, citológiai vagy biokémiai).



Kvantitatív detektálás:

A különböző infekciós ágensekre a kiértékeléshez specifikus kritikus kvantitatív szinteket állapítottak meg melyek összhangban vannak a fertőzések klinikai manifesztációjával (pl.: "vírus telítettség" HCMV esetében). Ez a kritikus kvantitatív szint nincs minden mikroorganizmus esetében megállapítva. Az eredmények összehasonlításakor amikor egy fertőzés alakulását értékeljük ki, figyelembe kell venni, hogy a detektálási spektrum határain a hibaszázalák nagymértékben megnő a kvantitatív mérések során (pl.: kezelés előtti és utáni értékek). Az infekció mértékének objektív megállapításához elengedhetetlen a kapott értékek (pl.: mintatérfogat, sejtszám stb.) és a detektálási folyamat standardizálása.


Klinikai minták elkészítése és szállítása a laboratóriumba:

A PCR metodikával minden klinikai mintából detektálhatjuk a mikroorganizmusokat – testnedvek (liquor, BAL, könny, köpet, szérum, plazma, sperma, vizelet), szövetek, bőr biopsziák, katéterek, implantátumik stb.; EDTA-ban nem koagulált vért. A mintákat nem szabad transzportáló médiumben szállítani! Fontos, hogy különbséget tegyünk a DNS és RNS detektálás közt (NK stabilitás). A vizsgálatra szánt kivont DNS-t (baktérium, kandidák, gombák, protozoák és DNS vírusok) 4 ºC-ra hűtve 24 órán belül használjuk fel, ha a szállítás/tárolás ennél tovább tart, a mintákat fagyasszuk le. Az RNS mintákat (hepatitis C vírus, enterovírusok, stb.) 4 ºC-ra hűtve 4 órán belül használhatjuk fel, vagy fagyasztva -20—70 ºC-on tároljuk felhasználásig. Tartsuk szem előtt, hogy mivel az eljárás nagy érzékenységű ezért a minta preparáció során nagy a kontamináció veszélye. Az eljárás nem kultivációs metodika, így a patogéneket nem szükséges életben tartani.

Radek Horváth
Molecular Diagnostics Laboratory



A "Molekuláris biológiai diagnózis a klinikai vizsgálatokban" doc formátumban letölthető itt.


Árlista letölthető: GeneProof-Costumer-2007.xls