Az influenzavírusok molekuláris evolúciója

Alapvirológia

Virion

Az influenzavírusok az Orthomyxoviridae családjába tartoznak. A virion kb. 100 nm átmérőjű és envelop-pal rendelkezik (9.1. ábra). Genomja egyszálú, negatív RNS, amely 8 szegmentre oszlik és összesen 10 polipeptidet kódol. Az RNS-szegmentek/gének (csökkenő méretben) az alábbi fehérjéket kódolják:

1-3 : RNS-dependens-RNS-polimeráz

működéséhez szükségesek, PB1, PB2 és PA

4 : hemagglutinin, HA

5 : nukleoprotein, NP

6 : neuraminidáz, NA

7 : mátrix fehérjék, MA1 és MA2

8 :nem-strukturális fehérjék, NS1 és NS2

Az influenzavírus genomja

A HA és NA felszíni nyúlványok a vírus adszorpcióban, sejtbe hatolásban és kiszabadulásban játszanak szerepet.

Típusok, altípusok

Az NP és M1 belső fehérjék antigénszerkezeti eltérései alapján három típust különböztetnek meg: influenza A, B és C. Mivel jelentős járványokat csak az A-típusú törzsek okoznak a továbbiakban csak ezekkel foglalkozunk.

A HA és NA antigénszerkezeti különbségei alapján pedig a vírustörzsek al- vagy szubtípusokba oszthatók. A HA-nak 14 féle (H1-14), az NA-nak 9 féle (N1-N9) szubtípusát találták eddig. Az egyes HA szubtípusok közt akár 30%-os aminosav szekvencia eltérés is lehet.

Az influenza A vírusok evolúciójának értelmezését jó néhány jelenség zavarja

Most joggal várhatnánk, hogy a Filogenetikai gyorstalpalóban tanultakat alkalmazva, az elsőnek tárgyalt vírusmodell evolúciója nyitott könyvként áll előttünk, csak olvasni kell belőle. De ez nem egészen így van, mert az influenzavírussal foglalkozó közlemények jó részében keveredik a gén- és vírusevolúció, a járványok kialakulásával, de az is lehet, hogy járványtani témájú munka található evolúcióra utaló cím alatt. Hogy az így előállt csapdákba ne essünk bele, hántsuk le a szigorúan vett vírusevolúciós témáról a vele összefonódott (egyébként fontos és érdekes) problémákat és ezeket tárgyaljuk külön. Lássuk előbb, hogy melyek ezek a zavaró problémák.

a) Vírusevolúciós címszó alatt gyakran nem filogenetikai munkát, hanem molekuláris epidemiológiai vizsgálatok vannak. Tény, hogy a molekuláris módszerek tették lehetővé a sporadikus influenza megbetegedések és járványok kialakulásának és lefolyásának megértését is, de az érdekes történetek szinte elfedték a �tiszta� evolúciós eseményeket. Ezért a vírusok átalakulásának követését ne keverjük össze a járványok történetével.

b) Az influenzavírusok klasszikus molekuláris evolúciós (filogenetikai) vizsgálatakor figyelembe kell venni, hogy a genom nyolc, fizikailag különálló szegmentből áll, amik kevert fertőzés során (elvileg) szabadon kombinálódhatnak (reassortment). Összesen 64 (?)-féle génkombinációt tartalmazó vírus keletkezésére van lehetőség, bár ennél csak jóval kevesebb kombinációt találtak. Így is felmerül a kérdés, hogy mivel a gén- és vírusfa nyilvánvalóan nem fog megegyezni, akkor milyen alapon választunk ki egy reprezentatív gént az influenzavírus filogenetikai vizsgálatához, illetve a kiválasztott gén mit fog reprezentálni.

c) Alig ismerünk más olyan vírust, ahol az immunszelekció hatását ennyire beépítették volna a vírus evolúciós és járványkeletkezési magyarázatokba, holott erre korántsincs annyi bizonyíték (ld. később). Ha pedig ennek ellenére mégis alakít a víruspopulációkon, akkor szembe kell nézni azzal, hogy bizonyos fajokból (emlősök) nem egy zavartalanul evolválódott víruspopuláció mintái kerülnek izolálásra (mint mondjuk, növényvírusok gyűjtésekor), hanem az, amit az immunszelekció meghagyott. Mivel a szelekció csak a felszíni fehérjékre (HA, NA) hathat, bármilyen, pl. rekombinációval szerzett belső fehérjék génjei a fitness-re való tekintet nélkül merülnek alá (vagy fel) a populációban.

Ezzel szemben a vadmadarakból gyűjtött vírusok (állítólag) koránt sincsenek (ekkora) szelekciónak alávetve, akkor viszont nyilván másféle összetételű lesz az ezekből származó víruspopuláció.

Az evolúciós értékelést zavaró eme problémák megismerése után térjünk vissza a filogenetikai alapelemekhez és kíséreljük meg ezek felhasználásával követni a vírusevolúciót, most csak érintve a járványvonatkozásokat.

Induljunk ki abból, hogy az influenza A vírusok közti géncserék (reassortment) miatt a génfa és vírusfa valószínűleg nem lesz kongruens, ezért kezdjük az ismertetést a gének szintjén. Hogy érzékeltessem a �tiszta� filogenetikai analízis eredményei és a járványtani vonatkozásokkal kiegészített történések különbözőségét, a témát mindkét szemszögből bemutatom (kockáztatva egyes helyeken az átfedést is).

Influenza A vírusGÉN-ek filogenetikai viszonya

Mindenek előtt egy, a vírust reprezentáló gént kellene választani a vírustörzsek filogenetikai leszármazásának megállapításához. Ha a vírus 8-féle génje szabadon kombinálódhat, akkor ennek az lehet a következménye, hogy bizonyos izolátumokban az egyes gének egymáshoz viszonyított kora eltérő lesz. (A 2.10. ábrán már láttunk arra példát, hogy két evolúciós tempóban különböző gén alapján szerkesztett species-fák nem egyeztek meg.)

A folyamatos szálú RNS-vírus genomok bármelyik szakasza (elvileg) reprezentálja a genomot, mert lehetnek ugyan rajta gyorsabban vagy lassabban változó szakaszok, de ezek minden vírustörzsben ugyanott találhatók, a genom különböző régiói pedig együtt evolválódnak. Ennek megfelelően bárhonnan is veszünk szekvencia mintát, az ezek által meghatározott filogenetikai viszonyok azonosak lesznek, ami abban nyilvánul meg, hogy a különböző szakaszok szekvenciája alapján szerkesztett kladogramok topológiája megegyezik, azaz a fák kongruensek lesznek. Ha viszont olyan vírusokat hasonlítunk össze, amelyekben a gének fizikailag is elkülönülnek, szegmentcsere miatt elképzelhető, hogy a gének közt nincs koevolúciós viszony. Így előfordulhat, hogy amikor egy véletlenszerűen kiragadott szegment alapján végzünk filogenetikai összehasonlítást, a készült kladogramról mindaddig ki sem derül, hogy nem az �igazi� viszonyokat tükrözi, amíg ugyanezen törzseket egy másik vagy több, a többi génnel koevolúciós viszonyban levő szegment alapján meg nem vizsgáljuk. A nem kongruens fák olyan filogenetikai viszonyokra utalnak, ahol az alapul szolgáló gének mintha nem is ugyanazokból a vírusokból származnának.

A génbankban ma már rengeteg influenzavírus szekvencia áll rendelkezésre és annak sincs akadálya, hogy ugyanazon törzsek mindegyik génjének kladogramját összehasonlítsuk. Ha ezt megtesszük és a különböző génfák topológiája megegyezik, akkor a vizsgált vírusok közt nincs reassortant (idegen gént hordozó rekombináns), ha viszont valamelyik gén fája eltérő topológiája miatt �kilóg a sorból�, az a gén nem mindig evolválódott együtt a többiekkel. Ugyanakkor, ha több gén fája kongruens, akkor ezek szinkronban, sőt valószínű, hogy egymástól szétválaszthatatlanul evolválódtak.

A 9.2. ábrán különböző influenza A vírusok génjeinek kladogramját mutatjuk be, néhány fontos példa illusztrálására. Szembeötlő, hogy az NP (nukleoprotein) és a PA (polimeráz) parsimony-analízise egybevágó (kongruens) kladogramokat eredményez. Ez azt jelenti, hogy a különböző időben, különböző fajokból származó influenza A vírusok ezen génjei nemcsak nem cserélődtek, de ha igen, azt együtt (párban) tették. (Más vizsgálatok is megerősítették, hogy az NP és PA gének egymástól függetlenül nem cserélődnek.). Tehát az influenza A vírusokban az NP és PA gének leszármazása mindig közös, akármilyen gazdát is jártak meg előzőleg az ezt hordozó vírusok.

Eltérő (inkongruens) kladogram illusztrálására nézzük meg az M-gént. Ezen a fán két gazdafaj vírusánál van jelentős különbség: a sirály (gull) M-génje ancesztrális leágazása miatt jóval öregebb (ősibb), mint az NP- vagy PA-génje, utóbbi fáján ugyanis recens leágazásokat látunk. A ló (equine 2) vírusának viszont az M-génje a fiatalabb, szemben az NP- és PA-génnel.

Csak ebből a három kladogramból még további összefüggések is leolvashatók:

- a legkorábbi leágazáson mindenhol az equine (ló)1 található, tehát valószínű, hogy ennek és az összes többinek volt közös őse;

- a ló influenzavírusai (equine 1 és 2) egymástól függetlenül kerültek a lóba;

- az észak-amerikai (North American = N.Am.) és óvilági (old world =OW) madár influenzavírusok a hosszú geográfiai elkülönülés miatt már két ágra szakadtak;

- a sertés és emberi influenzavírusok közös ősének létezését (azaz, hogy ezek sister-viszonyban vannak) minden gén vizsgálata alátámasztja.

Influenzavírus GÉNEK filogenetikai fái

Érdekes azonban szemügyre venni két hemagglutinin gén (a H1 és H3) leszármazásait is, mert a filogenetikai információkon túl, azt is illusztrálják, hogyan teszünk szert egyúttal járványtani következtetésekre:

- ha a H1 HA-fájára nézünk, megállapíthatjuk, hogy a humán és sertés törzsekben levő H1-nek madár HA volt az őse;

- sőt azt is, hogy az óvilági avian H1 nem régen ismét átment sertésre (Avian-swine, H1N1 ld. később);

- a H3 génfa is jó néhány információval szolgál: az outgroup-ként mellé tett H4 HA szintén új- és óvilági ágra divergálódott, a humán H3-nak (ez volt a Hong Kong-i pandémia HA-ja, ld. később) óvilági (ázsiai) avian H3-mal van közös őse, de amint az emberbe került, evolúciója felgyorsult (hosszú ágon ül).

GÉN-evolúció immun-semleges környezetben

Az influenza-gének diverzifikációjának alapmechanizmusa a nukleotida-szubsztitúció. Ennek fenntartója az RNS-polimeráz korrekciós képességének hiánya. Az evolúciós tempóra (rate-re) 10^-3-10^-4 nukleotida szubsztitúció/hely/replikáció értéket szokták megadni (8.2. fejezet).

Az RNS-polimeráz működését úgy kell elképzelni, hogy akármelyik szegmentet is replikája, a másolási hűség (vagy pontatlanság) foka azonos. Vagyis számára nincsenek fontosabb gének, amiket nagyobb pontossággal kell másolni, mint más, kevésbé �értékes� géneket. Nincs adat arra vonatkozóan, hogy az RNS-polimeráz képes lenne változtatni a másolás hatásfokán, attól függően, hogy milyen gént másol, vagy hogy milyen fajú gazdából származik a vírus. Ezzel jókora ellentmondásban, az irodalmi adatok tömege szerint a járványesetekből származó és egyéb mezei influenzavírusokban a felszíni gének változása gyorsabb, mint a belsőké és a madárvírusok evolúciója lassúbb, mint az emlősöké. A jelenséget vagy a polimeráz szelektív működésének, vagy az immunszelekciónak kell tulajdonítani.

Minthogy a másolás során a polimeráz nem diszkriminál aszerint, hogy milyen gént replikál, fel kell tételezni, hogy minden, a gének evolúciós tempójának egyenlőtlenségére vonatkozó utalás, az immunszelekció utáni adaptálódás torzító hatásának tudható be, beleértve a mintavételt: a vizsgálatra kerülő vírustörzsek (és génjeik) a felszíni fehérje alapján szelektált populációk túlélő maradványai.

Ezért igen fontos, mert feltehetően nem torzított adatokat nyerhetünk, immundeficiens szervezetekben zajló perzisztens fertőzés alatt sorozatban izolált vírustörzsek analízise. Ilyen adatokhoz csak kivételesen lehet hozzájutni, pl. amikor kombinált súlyos immunodeficiens szindrómában szenvedő páciens (a steril környezetben tartózkodás ellenére) véletlenül még influenzát is kap. A normális esetben 1-2 hét alatt lezajló fertőzés, az immunhiányos környezetben a védekezés hiánya miatt hónapokon át folytatódik. Ha tehát ilyen perzisztens fertőzés folyamán néhány hónapos időközzel vett minták szekvencia-változását vizsgálják meg, joggal mondhatjuk, hogy az immunszelekció nélküli és kizárólag a polimeráz hatékonyságától függő genetikai diverzifikálódásnak leszünk tanúi. Ebben a környezetben mérhető változás mértéke és tempója lesz az az alapvonal, amihez minden más, tehát természetes esetből származó (mezei) izolátumoknál megállapított adatot viszonyítani érdemes. Egyébként nincs is más mód, hogy természetes gazdában (emberben) tanulmányozzuk a vírusgének önálló, szelekció nélküli evolúcióját. Egy H1N1 szubtípussal fertőződött páciensben követték két gén evolúcióját és a következő alapértékeket állapították meg:

a) A belső NP és a külső HA gén szubsztitúciós rátája 5x10^-3- 2x10^-2 nukleotida-csere/hely/év között volt, ami megfelel az RNS-vírusok gyors evolúciójára forgalomban levő értékeknek.

b) A nukleotida cserék kb. fele vont maga után aminosav-változást: a nem-szinoním (d_N) (kódoló) és a szinoním (d_S) (nem-kódoló) szubsztitúciók aránya kb. 1:2 (d= difference). A molekuláris evolúció szabályai szerint a d_N:d_S arányából következtethetünk arra, hogy a változások szelekció hatására történtek-e. Ha d_N>d_S, akkor pozitív szelekció történt, ha d_NS, akkor a fehérje funkcionális vagy szerkezeti meghatározottsága (constraint) nem �enged át� a mutációs kínálatból a fehérjébe, azaz negatív a szelekció. Esetünkben a d_NS (arányuk: 0,5), csupán ezt látva tehát azt kell mondani, hogy immundeficiens környezetben valóban nincs jele a szelekciónak, ami a körülményeket ismerve nem is meglepő.

c) Filogenetikai szempontból érdekes megfigyelés volt, hogy a rendszerben a HA és NP genetikai heterogenitása nem úgy változott, ahogy elvárták, nevezetesen, hogy az első mintához képest a következő hónapokban újabb és újabb változások jelentek volna meg és ezek mindig hozzáadódtak volna az előzőekhez, azaz a mutációk progresszív felhalmozásának nem volt jele. Ezzel szemben minden mintavételkor különböző és egyedi összetételű heterogén populációkat találtak. Vagyis egy-egy heterogén populáció (kvázispceis) random fluktuációja volt megfigyelhető.

Az NP-gén diverzitásán alapulnak a gazdaspecifikus A-vírus csoportok

Az NP a vírus legnagyobb arányban keletkező fehérjéje. Amellett, hogy az RNS szegmenteket védi (strukturális szerep), valószínűleg szerepet játszik abban is (talán együttműködve más génekkel), hogy a vírus milyen fajú gazdasejteket tud megfertőzni. A 9.2. ábrán az NP kladogramján öt nagyobb ágat lehet megkülönböztetni a (vírus)gazdák szerint és ez az elkülönülés az NP antigénszerkezetében is megjelenik. Ugyanis ezen az alapon az influenza A vírusok öt nagy gazdapsecifikus csoportot alkotnak:

- régebbi ló vírusok (equine 1, egyetlen H7N7 szubtípusa van);

- újabb ló vírusok (equine 2, H3N8 és a többi H7N7);

- klasszikus sertés és humán vírusok (H1N1);

- sirályvírusok (H13);

- összes többi avian vírus (főleg vadkacsából, H1-12 és H14, valamint N1-N9).

A legnépesebb, az avian csoport vírusai földrajzi eredetük szerint is szeparálódnak újvilági, óvilági és ausztrál genetikai vonalakra, ami ugyancsak növeli a heterogenitást.

Ez azért fontos diagnosztikai lehetőség, mert egy reassortáns (genetikailag nem homogén) vírusról nem is olyan egyszerű megmondani, hogy valójában milyen fajú (ld. később is). Ha pl. egy izolátum szubtípusa szerint (szerológiai próbában) H3, attól még hu, av, sw és eq bármelyike lehet. Az NP genetikai vizsgálata határozottan eldönti, hogy melyik fajhoz adaptálódott a vírus. Az sem meglepő, hogy az adott H3 genetikai analízise is megmondja honnan jött, hisz� a H3-ak a különböző fajokban már eléggé divergálódtak ehhez, hacsak a vírus nem éppen most ment át egy másik gazdába (ld. később).

A HA-gének filogenetikai analízise

Az influenza A vírusoknak antigénszerkezetileg 14-féle hemagglutininje van, amelyek egyszerű szerológiai próbával (HA-gátlás) megkülönböztethetők. Közülük a legtöbb (a H13 kivételével mind) vadkacsában található, emberben és más emlősökben pedig csak néhány (9.1. táblázat). A HA-nek három szinten is divergálódtak:

a) valamennyi szerológiailag megkülönböztethető HA szubtípus (H1-14) jelentősen �szétfejlődött� az idők folyamán (9.3. ábra). A HA-génfa szerint pl. a H9, ami influenza A-ba tartozik, leszármazásilag közelebb van az influenza B-hez, mint mondjuk az ugyancsak A-típusú H3-hoz. A HA-génfa (melyen zömmel madár HA-ek láthatók) vizuális cáfolata az influenza irodalomban hangoztatott azon felfogásnak, hogy a madár eredetű vírusok génjei evolúciós sztázisban vannak (legfeljebb egyesek).

b) A másik, kisebb fokú diverzifikálódást azokon a homológ géneken látjuk, amelyek különböző gazdafajokban előforduló vírusok részei. A 9.1. táblázaton látható, hogy a HA H1 szubtípusa előfordul vadkacsában (av), sertésben (sw) és emberben (hu) élő influenza A vírusokban. Az avH1, a swH1 és a huH1 azonban egymástól genetikailag meglehetősen szeparálódtak;

c) mint ahogy a különböző vírustörzsekben levő huH1-ek is tovább divergálódtak (pl. földrajzi hely vagy járványok szerint).

HA-gének filogenetikai viszonya

Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy:

- az influenza A gének filogenetikai vizsgálata felderítette, hogy vannak köztük olyanok, amelyek nem közösen evolválódtak a többiekkel, ami arra utal, hogy az influenzavírusok evolúciója során egyes gének átkerülnek más vírusokba (reassortment);

- bár elvileg minden génnek saját genealógiája lehet, a koevolúciót mutató gének (pl. NP és PA) kladogramja viszont hasonló;

- azt, hogy melyik vírusnak melyik faj a gazdája (eredeti), főként az NP-gén határozza meg, de a nem, vagy kevésbé fajspecifikus gének (HA) nagyfokú divergenciát értek el;

- immunhiányos szervezetben való evolúciója során az influenzavírusra időben változó, más és más összetételű (fluktuáló) heterogén populációk jellemzők, ami a kvázispecies tulajdonságait mutatja, nem pedig mutációkat kumuláló progresszív leszármazási vonalat.

Génevolúciós sajátosságok természetes fertőzés alatt

Az influenza A-típus, mint láttuk, óriási diverzitást rejt magában, amely mind genetikai, mind fenotípusos szinten (antigén szubtípusok, variánsok) megnyilvánul. A típuson belüli genetikai elkülönülések azonban szinte direkt vagy indirekt módon a gazdához is kötődnek. Három olyan tényezőről lesz szó, amelyek az A-típus populációgenetikáját jelentősen befolyásolja: a gazda földrajzi elterjedtsége, faja és immunállapota.

Filogeográfiai összefüggések

A biogeográfiai vizsgálatok feltárják a földrajzilag elkülönült, de filogenetikailag rokon fajok kialakulásának okát. Ennek analógiájára, különös lenne, ha egy gyorsan mutálódó vírus genetikailag homogén maradna, amikor tucatnyi gazdája van és ezekre pedig globális és földrajzilag meghatározott elterjedtség jellemző. A gazda faja és földrajzi elterjedtsége annyira jellegzetes nyomot hagy a genetikai szerkezeten, hogy akár már erről felismerhető egy vírusizolátum.

A 14 féle avHA-ból 13 vadkacsákban is előfordul (a H13 csak sirályban). A bemutatott vírusgén-fák mindegyikén (de a többin is) feltűnik a gazdák amerikai és európai élőhelyek szerinti elkülönülése. Így nem okozhat meglepetést a többi (emlős) gazda szerinti genetikai szeparációk kialakulása sem, mégha egyik-másik vírusnak a sertés vagy az ember csak másodlagos gazdája is. Éppen a másodlagos gazdában való génevolúció tanulmányozása vezetett arra a felismerésre, hogy egy gén (pl. H3) mutációs tempója felgyorsulhat, amint primer(ősi) gazdából (pl. madárból) átkerül pl. emberhez már adaptálódott vírusba (ld. 9.8. fejezetet). Ezt a következtetést azokból a meglepő adatokból vonták le, melyek szerint a madáreredetű influenzavírusok genetikai heterogenitását alig követi aminosav változás, ezért itt evolúciós stagnálásról is beszélnek. Az emberben észlelt vírusevolúciós ütem emelkedés pedig az avian vírusokhoz képest következett be. A jelenséget fajspecifikus vírusevolúcióként is emlegetik. Amikor ennek okát kutatták, az immunszelekció merült fel mint lehetséges magyarázat, jóllehet, mint már szó volt róla, a dN és dS (kritizált módon való) viszonyítása alapján a szelekciót nem sikerült igazolni. Mégis, az adatok zöme azt mutatja, hogy a felszíni fehérjék dN szubsztitúciós rátája jelentősen magasabb, mint a belső fehérjéké. Bár csak indirekt módon, ez szintén az immunszelekció mellett szól (9.1. táblázat).

Mutációs ráta egyes influenzavírus génekben

			dN		dS
HA (H3)	hu		1,9 x 10-3		2,5 x 10-3
NP	hu		0,4 x 10-3		1,8 x 10-3
	av		0		1,2 x 10-3
M1 (belső)	hu		0		0,8 x 10-3
M2 (külső)	hu		0,5 x 10-3		0,9 x 10-3

Az NP-gén filogenetikai fája jól illusztrálja, hogy amíg az emlős vírusok nukleotida- és aminosav-szekvencia diverzifikációja megegyező dinamikájú (mert arányosan nő az aminosav szubsztitúció), addig a kacsa izolátumok nukleotida divergálását csak jelentéktelen fehérje változás követi (9.4. ábra is).

Az influenza A vírusok genetikai és aminosav diverzitásának eltérése

A madár és emlős A-vírusok génjeinek evolúciós különbségét azzal magyarázzák, hogy a nagyfokú adaptálódás miatt a madárban az immunszelekció mérsékelt módon működik. Valószínű azért, mert a vízimadarak vírusai a bélcsatornában szaporodnak, ahol (miközben semmiféle tünetet nem okoznak gazdáiknak) kevésbé érhetők el az immunfolyamatok számára. Nem úgy mint az emlős vírusok, amelyek a légutakban szaporodnak, ahol nem kerülhetik el az immunrendszer ellenlépéseit. A szelekció kényszere alatt un. escape (ellenanyag által nem neutralizált) mutánsok keletkeznek, amelyek a következő vírusvonalak alapozói lehetnek.

Az influenza A vírus a természetben: fertőzöttség, megbetegedés és járvány a különféle gazdákban

A fenti három tényező valamely gazdához való viszonya annyira összetett és sokrétű, hogy csak ezek egyenkénti tisztázása révén érthető meg a különböző influenzajárványok keletkezése és a járványokozó törzsek eredete. Az influenza A vírusnak gazdákhoz való viszonyában az adaptáció fokozatossága figyelhető meg.

Az A-típusú vírusok a primer gazdának számító rezervoárban (vadkacsában) csak tünetmentes fertőzést tartanak fenn. Innen azonban időnként más fajra patogén vírusok kerülnek át új gazdákba (fókába, lóba, csirkébe, emberbe), ahol akár súlyos megbetegedéseket is okoznak, de közben terjedő képességük csak mérsékelt marad, ezért az ilyen új keletű (recens) gazdafoglalást nem követi tartós járvány. Ám a madárvírusok valamikor jelentős evolúciós lépést jelentő gazdaváltást hajtottak végre, amikor új gazdákban, sertésben és emberben, nemcsak megtelepedtek (adaptálódtak), hanem gyakran súlyos járványokat is okoznak. Utóbbiak vírusai időnként avian influenza eredetű vírusgénekkel frissítik fel génállományukat, de fajon belüli vírusokkal is rekombinálódhatnak.

nfluenzavírus típusok (A, B és C) és altípusok egyes fajokban

Viszony	A eredeti másodlagos*	B	C
Fertőzés Betegség (járvány)	vadkacsa (H1-12, H14, N1-9) sirály (H13) csirke (H5, H7) - ló (H3N8, H7N7) sertés (H1N1, H3N2) ember (H1-3, N1-2)	Ember ember (enyhe)	ember ember (enyhe)

* recens és evolúciós jelentőségű gazdafaj-váltás

A fő rezervoár (a vadkacsa) vírusai

Az influenza A vírusok �univerzális� és központi rezervoárja tehát a vadkacsafélék. A vírus a vadkacsák bélcsatornájában igen magas titerben szaporodik és a fertőzés után napokon át nagy mennyiségben kerül a környező vizekbe, így a terjesztés rendkívül hatékony. Kacsákban ugyan valamennyi HA és NA szubtípus előfordul, de csak tünetmentes fertőzés formájában (9.5. ábra).

Az influenza A vírusok rezervoárjai és gazdái közti viszony

Az észak-amerikai kontinensen a tavaszi kelés után őszig (a vándorlásig) szinte minden fiatal vadkacsa fertőződik az ott uralkodó variánssal (vagy többel). További influenza gén-pool-ok léteznek Oroszországban, Dél-Kínában, a Közel-Keleten stb. A trópusi éghajlaton azonban nincs szezonalitás, mint a mérsékelt égövön, ezért egész évben folyik a vírusürítés és terjesztés.

A kacsában apatogén vírusok más fajokban megbetegedéseket okoznak

Minden más faj fertőzésének vagy génszerzésének eredeti forrása a vízimadár influenzavírus-, illetve gén-poolja. Az egyéb fajokban, azonban jóval szűkebb a vírus-variáció és csak néhány altípus képes új gazda elfoglalására, megbetegítésére pedig ezeknek is csak egy része (9.2. táblázat). Egy új faj kolonizációjára mindig influenza(szerű)betegség kitörése kapcsán terelődött a gyanú és csak genetikai analízissel lehetett az egyes influenza-esetek kórokozóinak eredetét egyértelműen igazolni.

Az alábbiakban a súlyos következménnyel járó fajhatár átlépésére hozunk fel példákat.

Sporadikus influenza megbetegedések házimadarakban (Avian influenza, AI)

Csirkében a H5 és H7 szubtípusú HA-t hordozó egyes variánsok magas pathogenitással rendelkezhetnek, halálos kimenetelű fertőzést okoznak és néha járványos formát is ölthetnek. Ilyen járvány tört ki 1983-84-ben Pennsylvániában, amelyet egy H5N2 szubtípus okozott. Ennek avirulens változatai azonban még évek múlva is perzisztáltak a nagy amerikai élőbaromfi-vásárokon. Ez a vírus is teljes egészében (mind a 8 génje) kacsaeredetű volt és amikor először észleleték, még csak pár százalék elhullást okozott. Pár hónap múlva azonban már mind terjedőképessége, mind virulenciája fokozódott és közel 100 %-os mortalitást idézett elő. Közben a HA-n több pontmutáció keletkezett, amelyekkel a virulencia fokozódását magyarázzák.

Influenzavírus okozta pestisszerű megbetegedések már a századfordulón is előfordultak, ezt a betegséget nevezték korábban klasszikus baromfipestisnek (fowl plague(FP)-nek). A 30-as évekből fennmaradt iztolátumok a H7N7 vagy H7N1 szubtípusba tartoznak.

A legutóbbi, csirkékre halálos madárinfluenza (AI) 1997-ben, Hong Kong-ban tört ki, amelyet rövidesen halálos emberi megbetegedések is követtek. Ebből az esetből H5N1 altípust izoláltak (ld. később).

Mind az amerikai élőcsirke-vásárok, mind a Hong Kong-i igen zsúfolt csirketartási gyakorlat bizonyos tekintetben a vírusvariánsok bölcsőjeként tekinthető vadkacsák biotópjára emlékezetet, amennyiben ezekben igen rövid idő alatt, nagyszámú vírusátvitelre kerülhet sor. Ezek a kacsából csirkébe származott vírustörzsek az előbb említett kedvező adaptációs körülmények ellenére sosem érték el azt a patogenitási szintet, ami önálló, egyik helyről a másikra terjedő járványok kialakulásához szükséges.

Avian influenza vízi emlős fajokban

1979-80-ban az USA északnyugati partjainál kikötői fókákban lépett fel elhullással és súlyos tüdőgyulladással is járó légzőszervi megbetegedés. Az esetből influenzavírust izoláltak, amely nemcsak H7N7-nek bizonyult, de kiderült, hogy valamennyi génje avian influenzavírus eredetű volt. Ez volt az első bizonyíték arra, hogy természetes körülmények között egy genuin avian vírus in toto átlépheti a faj határát és emlősben gyors adaptálódás után súlyos megbetegedést okozhat.

Járványos formában jelentkező influenzák

A csirkén kívül három olyan faj van (sertés, ló és ember), amelyekben egyes influenzavírusok akármikor is kerültek át a madár rezervoárból (mindenesetre nem recens gazdafoglalásról van szó), olyan fokú adaptálódást értek el, melynek következtében megtelepedésük tartóssá vált és bár inkább csak enyhébb kimenetelű megbetegedést idéznek elő, de azt kivétel nélkül járványos formában.

Sertésinfluenzák

A sertésben különféle eredetű influenzavírusok okoznak járványos, de viszonylag enyhe megbetegedést.

Az avian H1N1 szubtípus 1979-80-ban jelent meg Észak-Európában. Eredetét tekintve ez is egy teljes (8 génes) avian influenzavírus. Annyira az, hogy a 90-es években �visszament� pulykára. Ez az �avian-like� H1N1 az eddig ismert leggyorsabban evolválódó vírus és ez a megállapítás valamennyi génjére igaz. Ennek az az oka, hogy az RNS-polimeráz génjében egy olyan mutáció (mutátor mutáció) keletkezett, amely fokozta a polimeráz hibás másolását, ami által nagyon heterogén és instabil víruspopuláció (kvázispecies) keletkezik. A vírus azonban a 90-es évek közepére �stabilizálódott�, elvesztette a mutátor mutációt. A jelenség azért tűnt veszélyesnek, mert még pár évvel ezelőtt is azt hitték, hogy az emberben súlyos járványt okozó madárinfluneza vírusa (vagy génje), csak sertésben, mint intermedier gazdában (genetikai �keverő edényben�) képes kombinálódni. Egy ilyen esemény ugyanis egyszer már lezajlott valamikor a század elején (vagy korábban). Ennek eredményeképpen jött létre a legrégebbi, a klasszikus sertés (sw) H1N1-vírus, ami az észak-amerikai kontinensen okozott először megbetegedéseket sertésekben és ott azóta is enzootiás, később azonban ez is átkerült Európába. Valószínű, hogy egy Kansas melletti katonai tábor lakói éppen ezzel a vírussal fertőződtek meg és 1918-ban ők hozták át Európába, ahol �spanyolnátha� néven vált ismertté (ld. később).

Humán-(like) H3N2: a 70-es években izoláltak sertésből a Távol-Keleten. A Hong Kong-i (1968) néven ismertté vált emberi pandémia okozójának őse, mi viszont eredetileg egy avian H3-ból evolválódott. Úgy tűnik, hogy a sertés, csakúgy mint az ember, nem számít a fertőzés szempontjából zsákutcának, sőt inkább közvetítő fajnak a madártól az ember felé. Bár új génkombinációk keletkezésének helyéül a Távol-Keletet (pl. Kínát) szeretik megjelölni (mert az a szoros sertés-ember kapcsolat, ami ezt statisztikailag valószínűsíti, csak ott lenne meg), az avian-like (H1N1) és humán-like (H3N2) sertés influenzavírusok első természetben lezajlott géncseréjét (reassortment) Olaszországban figyelték meg a 80-as évek közepén, alig néhány évvel azután, hogy ezek Európában megjelentek.

Mivel korábban nem volt példa a direkt madár Ž ember vírusátvitelre (kivéve1997-ben Hong Kong-ban), a sertést közvetítő fajnak tekintik, mert ez az egyetlen, amely emberi és madár influenza A törzsekkel egyaránt fertőzhető, mesterséges és természetes körülmények között egyaránt.

A lóinfluenzák

Igen nagy gazdasági jelentősége van a ló influenzájának (a versenyló �ipar� miatt). Két fő altípus okozza: a H3N8 (equine 2), ami szerte a világon elterjedt és a H7N7 (equine 1), ami ritkábban fordul elő. A múlt századra teszik ezeknek a sertés/ember vírusvonaltól való elválását. Érdekes, hogy 1989-ben a H3N8-nak Kínában megjelent egy tiszta (nyolc génes) avian formája, tehát egy madárvírus a többi hasonló eseménytől függetlenül itt is átlépett egy faji határt.

Influenzajárványok az emberben (9.6. ábra)

a) �Szeroarcheológiai� vizsgálatokkal megállapították, hogy a századforduló előtt valóstínűleg H2N2 és H3N8 altípusú vírusok cirkuláltak az emberi populációkban.

b) A spanyolnátha vírusa, mint már említettük, a szerológiai bizonyítékok alapján huH1N1 altípus volt, de eredetileg szintén az avian vírus-pool-ból származott, a század elejére azonban már jelentősen eltávolodott tőle. Ugyan az első ilyen vírust csak a 30-as években izolálták emberből és sertésből egyaránt, 1997-ben PCR-el sikerült 1918-ban tüdőgyulladásban elhalt személyek tüdejének szövettani metszeteiből RNS-maradványokat amplifikálni. A HA, NA és NP génekből rövid, de reprezentatív szakaszokat vizsgáltak és mindegyiket a humán/sertés csoportba tette a filogenetikai analízis. Ez volt az első direkt bizonyíték arra, hogy a spanyolnátha pandémiában már emlőshöz adaptált H1N1 vírus vett részt. (A spanyolnáthában csak az USA-ban 700 ezer ember pusztult el, köztük több mint 40 ezer katona Európában, de nem a frontokon. A világon kb. 20 millióra teszik a veszteséget.)

Emberi influenzavírusok evolúciója: időnkénti génfrissítés avian

influenzavírusból

c) A következő pandémia az ázsiai influenza, 1957-ben kezdődött és egy H2N2 szubtípus okozta. Ez a vírus az előzőből (H1N1) öt gént tartott meg és hármat (HA-t, NA-t és PA-t) cserélt le az avian gén-pool-ból.

d) Az 1968-as Hong Kong-i vírus, a H3N2, az előző vírusnak csak a HA- és a PB1-génjét váltotta le.

e) Nagy meglepetésre 1977-ben ismét a H1N1 tért vissza (Oroszországból származik), pedig az ötvenes években fordult elő utoljára. Azt hiszik, hogy laboratóriumból szabadult ki, mert nincs rajta olyan nukleotida-változás, ami arra utalna, hogy közel 30 évig a természetben �parkolt� volna, mialatt evolúciós órája �ketyegett�. A 80-as években fordult elő először, hogy egyszerre két szubtípus (a H3N2 és a H1N1) keringett az emberi (és sertés) populációkban. Mivel a korábbi pandémiákban csak egyetlen vírust találtak, szinte dogmává vált az �egy járvány, egy szubtípus (variáns)� elv.

Az evolúciós ismereteket talán elsőként éppen az influenzajárványok keletkezésének és megjelenésük szabályszerűségének magyarázatára használták fel. Szinte dogma lett, hogy amint egy minden szempontból sikeres járványtörzs elkészült a természet műhelyében, az előző szubtípust �kiszorította� és világszerte szétterjedt, hiszen az emberi populációk ezzel az új kombinációval szemben még nem tartalmaztak ellenanyagot (immunológiailag �naivak� voltak). Az �egy járvány egy vírus� elv az alapja annak a védekezésnek, ahol a vakcinának szánt törzseket is az új szubtípusok szerint válogatják. Növelte a szabályosságba vetett hitet, ezáltal a predikció esélyét, hogy megfigyelték, az új sikeres járványtípusok a régire épülve keletkeznek (H2N2ŽH3N2). Mindkét dogmát megdöntötték az események és a hátterükben meghúzódó molekuláris módszerekkel felderített folyamatok: 1977-ben a H1N1 tért vissza, akkor, amikor a H3N2-ből �fejlesztett� szubtípusra (pl. H3N3-ra vagy H4N2-re stb.) számítottak (9.6. ábra). Ehhez képest a H3N2 még ma is velünk van, sőt ezeknek egy jó része folyamatosan belső fehérje géneket cserél egymással (azaz reassortment-tel �hajtja magát�), miközben HA és NA génjeik �csak� mutációval divergálnak. A H3N2 rekombinánsok kisebb-nagyobb sikerrel támadnak és gyakran ugyanazon a területen is éveken át párhuzamosan fordulnak elő.

Az �egy járvány-egy vírus� elv cáfolataként értékelhetjük a 9.7. ábrát ahol ritka kivételként egy szerkesztett (idealizált), de valódi vírus-geneológiát látunk, amelynek elágazásainál valódi vírustörzsek mutatják, hogy melyik melyiknek az őse. Az is teljesen világos, hogy bizonyos években egyszerre több vírus-lineage volt forgalomban (H3N2 immunkörnyezet ide, vagy oda).

Az influenza A és B vírus valódi evolúciós fája valódi közös ősökkel

f) Még két érdekes emberi járványról érdemes megemlékezni. Az egyik az 1997-es Hong Kong-i eset, ahol egy csirke influenza A (H5N1) vírus közvetlenül, teljes génállományával in toto átment emberre, de néhány esetnél megállt. A másik még 1979-ben történt Mongóliában, ahol egy régi (30-as évekbeli) labortörzs és egy újabb (Russia/77) járványtörzs (mindkettő H1N1) reassortant-ját használták vakcinázásra UV-inaktiválás után. A helytelen inaktiválás (és a genetikai alapismeretek hiánya) miatt élő patogén vírus reaktiválódott az oltott személyekben és ez terjedni kezdett, előbb csak a lakosság körében (bár csak enyhe tünetekkel járt, főleg fiatalokban). Ezt követően viszont átment a Mongóliában igen fontos gazdasági állatnak számító tevékre, ahol súlyos veszteségeket okozott. Ez az első esete egy ember kiváltotta, laboratóriumban �előkészített� járványnak.

A gazda-vírus viszony evolúciós tartalma

Logikailag a gazda-vírus koevolúció a rég(ebb)i múltra utaló jelenség, amennyiben minden vírus történetében volt legalább egy gazda, ahol �megfogant�, azaz kialakult. Ugyanakkor egy vírus új gazdában való megjelenése a nagyon jelentős evolúciós újítások körébe tartozik. A gazdafaj határának átlépése bekövetkezhet a gazda speciációján (így leszármazottain) keresztül, vagy faji határok átlépését lehetővé tevő saját (vírushoz tartozó) evolúciós újítások révén. E gondolatmenetet követve az újabb időkben történt gazdafoglalás a recensebb megnyilvánulás és a legkülönfélébb vírusoknál látjuk, hogy az új gazdák időbeli sorrendisége is megállapítható (még ha évmilliókkal ezelőtt történt is). Az új-gazda-foglalás korára vonatkozó találgatásban segít a vírus-gazda egyensúly állapotának felbecsülése is.

Láttuk, hogy az influenzavírusok (hacsak egy-egy génjük részvételével is) kiterjedten élnek a gazdafoglalás lehetőségével, amelyet a szegmentált genom előnyei messzemenően elősegítenek. Ezeknek a folyamatoknak, különösen amikor járványok kialakulásához vezettek, szinte minden eseményét érintettük, amelyek ebben az évszázadban lezajlottak. Az influenzavírus evolúciójának még korábbi történései azonban jórészt ismeretlenek.

A gazda és kórokozója között kialakult viszony értékelése azonban lehetővé teszi, hogy mégis kicsit messzebbre is lássunk a múltba. A mai felfogás szerint egy ideális egyensúlyi helyzetben a vírus hatékonyan szaporodik az egyedben és populációban egyaránt, de csak minimális patogenitással rendelkezik és viszonylag nagy genetikai diverzitást generál. Az influenzavírus-gazda egyensúly fenti követelménye leginkább a vadkacsában valósul meg. Nagy a gazdafaj geográfiai elterjedtsége, fertőzésük teljesen tünetmentes, igen nagy mennyiségű vírust ürítenek (> 10⁸ vírus/gramm bélsár) és ez jól terjed a vízzel. Az avian szubtípusokon belül a HA-ek és NA-ok ha genetikailag nem is, de fenotípusosan meglepően homogének, ami arra utal, hogy evolúciós sztázisban vannak. Erre mondjuk, hogy a vírus adaptálódott.Ezzel szemben a többi gazdában az A-vírusok fehérjéinek evolúciós változása még gyors és sebesen távolodnak az avian változattól.

Az avian influenzavírusokról megállapított evolúciós jelentőséggel bíró adatok azonban egy nagy ellentmondásra irányítják rá a figyelmet, amelyre a válasz a gazda-vírus viszony időtartamában rejlik. Arról van szó, hogy a kacsavírusoknak a belső (NP) fehérjéje teljes evolúciós stagnálásban van (9.4. ábra). Ezzel a relatív lelassult evolúcióval van ellentmondásban a már szerológiai próbával, tehát jelentős antigenitásbeli különbségekben megnyilvánuló szintre evolválódott sokféle HA (9.3. ábra) és NA előfordulása. Ezek kialakulásához pedig sok időre volt szükség. A nagy heterogenitás és evolúciós sztázis látszólagos ellentmondását az oldja fel, ha feltételezzük, hogy az A-típusú vírusok már nagyon régen élnek a vadkacsákban. Az összes A-vírus és gazda viszonyból csak ez látszik olyannak, mint ami hosszú koevolúcióra utal. Ugyanakkor éppen a koevolúció (adaptáltság hiánya) magyarázza a másodlagos, de recens új gazdákban a fajhatár átlépése után, az egyensúly megbomlására utaló jelenségeket (gyors evolúció, patogenitás-növekedés, járványos megnyilvánulás).

Mindezek arra utalnak, hogy az ősibb, mert stabilabb forma, a madarak influenzavírusa lehet, míg a többi gazda A-vírusa azok leszármazottja.

http://www.vmri.hu/lomniczi/9_INFL.HTM